“精码”玉堂：肺泡灌洗液二代测序在儿童社区获得性肺炎诊疗中的应用价值
儿童社区获得性肺炎(CAP)是儿科的常见病和多发病，也是我国目前5岁以下儿童死亡的主要原因之一，具有起病急、进展快的特点，通常伴有发热、咳嗽、呼吸增快、肺部湿性哕音等表现，并有肺部影像学的异常改变。CAP病原体种类复杂多样，包含病毒、细菌、真菌、非典型病原体等。感染方式可以为单一病原体感染或混合感染，混合感染在肺炎病原体感染中占重要比例口]。如何准确、快速、全面识别病原体，予以精准、合理用药，以减少抗生素的不合理使用，降低病死率和后遗症的发生，降低医疗费用口]，已成为CAP诊治中的难题。传统的病原学诊断方法如涂片镜检、培养分离、免疫学检测等存在假阳性，阳性率低，对特殊病原体培养耗时长，特异度不高，步骤复杂、操作要求高，已经远远不能满足临床工作的需要。二代测序(NGS)无须经过实验室进行微生物培养，直接对标本中的DNA或RNA进行高通量测序，能够客观、快速地一次性检测出标本中的多种病原微生物，为急危重症和疑难感染性疾病提供了诊断依据，具有准确性更强、检测时效更好、无偏倚、全面覆盖及产出巨大等特点，在临床诊疗方面的应用越来越广泛。本研究拟通过NGS检测肺泡灌洗液，对比传统病原微生物检测方法，评估NGS的检验效能及临床应用价值。
资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年6月至2022年7月九江市妇幼保健院儿童呼吸科收治的116例CAP并行纤维支气管镜肺泡灌洗的患儿为研究对象，其中男60例，女56例；年龄1～14岁，平均(6.84±2.54)岁。纳入标准：(1)符合《儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019版)》诊断标准。①有发热、咳嗽或喘息、呼吸增快等症状；②肺部可闻及固定的湿性哕音，部分支原体肺炎患儿可无哕音；③胸部X线片或胸部CT提示存在大片状实变影，或存在肺不张，或合并胸腔积液。(2)符合《中国儿科可弯曲支气管镜术指南(2018年版)》适应证第9条胸部影像学异常。排除标准：(1)合并其他严重心、肝、肾等疾病；(2)影像学检查不支持支气管肺炎；(3)存在纤维支气管镜检查相对禁忌证；(4)家属拒绝行纤维支气管镜检查；(5)家属拒绝肺泡灌洗液外送第三方检测机构行NGS检测。本研究经医院伦理委员会批准(LLSC-2022-030)。所有患儿家属知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法
所有入组患儿均予以综合性治疗，经验性抗感染、补液退热、止咳祛痰及雾化吸入等对症治疗。完善传统的病原学微生物检测及血生化、炎症指标等相关检查。征得患儿家属同意后完善纤维支气管镜术前检查，行纤维支气管镜肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液，外送第三方检测机构行NGS检测。
1.2.1 传统病原微生物检测
包括血或痰培养、肺泡灌洗液培养、呼吸道病毒七项检测、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核抗体等检测。其中呼吸道病毒七项检测采用免疫荧光法，七项呼吸道病毒检测试剂盒购白海德诊断有限公司；肺炎支原体抗体检测采用被动凝集法，赛乐迪亚一麦可Ⅱ试剂盒购自富士瑞必欧株式会社；肺炎衣原体抗体检测采用酶联免疫吸附试验，肺炎衣原体IgM抗体检测试剂盒购自丽珠试剂股份有限公司；结核抗体检测采用胶体金法，结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒购自上海奥普生物医药股份有限公司。血或痰培养均为细菌培养法。上述检测严格按照试剂盒操作说明书进行。呼吸道病毒七项检测阳性提示存在相应病毒感染的可能性大，结合临床情况加以分析。肺炎支原体IgM≥1：160提示存在近期或急性感染，恢复期和急性期抗体滴度呈4倍或4倍以上升高或降低，提示肺炎支原体感染；滴度<1：160或阴性需结合临床表现加以分析。肺炎衣原体、结核抗体阳性需结合临床表现判断是否存在其他感染。血培养、痰培养及灌洗液培养阳性需结合相关菌落及临床表现判断感染菌、定植菌或污染菌。
1.2.2 NGS检测征
征得家属同意后将肺泡灌洗液外送第三方检测机构行NGS检测，采用靶向二代测序(tNGS)法。标本的采集、运输和保存严格按照公司的标准规范执行。采用广州XX生物科技有限公司的R6672—01B核酸提取或纯化试剂，广州市XXX生物科技有限责任公司tNGS试剂，广州市XXX生物科技有限责任公司KM MiniSeqDx-CN基因测序仪。操作过程：标本前处理一核酸提取一DNA／RNA建库一高通量测序。结果的判读：根据病原菌及其序列数，结合临床病情判定有无感染。
1.2.3 观察指标
(1)记录传统病原微生物检测结果、NGS检测结果；(2)比较NGS检测与传统病原学检测检出率；(3)比较NGS检测与传统病原学检测的一致性；(4)以临床综合判断结果为“金标准’’(采用肺泡灌洗液、血液、痰液等综合评估)，分析NGS结果与传统病原微生物检测结果与临床诊断的符合率。
1.2.4 统计学处理
采用SPSS25.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以x ̅±S表示，两组比较采用t检验；计数资料以例数或百分数表示，两组比较采用Z2检验；采用Kappa检验进行一致性分析，Kappa值>0.74表示一致性良好，0.40～0.74表示一致性尚可，<0.40表示一致性不佳。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
2.1 传统病原微生物检测结果
传统病原微生物检测结果 经传统病原微生物检测，116例患儿中共检出阳性94例(81.03％)，其中细菌感染4例(3.45％)、病毒感染2例(1.72％)、肺炎支原体感染83例(71.55％)、肺炎衣原体感染5例(4.31％)，包含混合感染9例(7.76％)。见表1。
2.2 NGS检测结果
对肺泡灌洗液进行NGS检测显示，116例患儿中共检出阳性111例(95.69％)，其中细菌感染62例(53.45％)、病毒感染58例(50.00％)、肺炎支原体感染99例(85.34％)、真菌感染5例(4.31％)，包含混合感染63例(54.31％)。见表2。
2.3 NGS检测与传统病原微生物检测的检出率比较
NGS对细菌、病毒与肺炎支原体的检出率高于传统病原微生物检测，差异有统计学意义(P<0.001)；2种检测方法对真菌及其他病原体的检出率对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
2.4 NGS检测与传统病原微生物检测一致性比较
NGS检测与传统病原学检测一致性不佳
(Kappa=-0.079，P=0.017)。见表4。
2.5NGS检测、传统病原微生物检测与临床诊断的符合情况 一般资料
NGS与临床综合诊断符合率为95.69％(111／116)，高于传统病原微生物检测的81.03％(94／116)，差异有统计学意义(x^2=12.114，P<0.001)。
讨论
CAP是肺间质与肺实质的感染性疾病，患儿可产生咳嗽、发热、呼吸困难等症状，病情严重时伴有呼吸衰竭，还可引起多器官功能衰竭，具有病情进展迅速、病死率高等特点。CAP的病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体、真菌、寄生虫等，病原体直接感染导致儿童死亡的肺炎占62％。故早期明确病原体对临床治疗方案的制订具有积极意义。传统病原微生物检测中微生物培养周期较长且阳性率低，而病原体特异性核酸序列PCR、抗原／抗体免疫学方法等仅针对已知病原，难以检测未知病原，临床应用存在一定局限性。
NGS采用高通量测序技术，能直接提取标本总DNA，使细胞彻底裂解，即便细胞在颗粒上附着，也能获取良好的破碎效果，有助于减少DNA流失，使微生物结构更完整，且无须微生物培养，检测过程包含标本采集、核酸提取、文库制备和测序、数据处理与分析、检测结果、报告解读，整个过程仅需2～3 d，与传统检测方法相比，大大缩短了检测周期，提高病原微生物的检测能力。本研究中，NGS检测的阳性率为95.69％，高于传统病原微生物检测的81.03％，与临床综合诊断符合率高于传统病原微生物检测，提示NGS检测能够提高CAP病原体阳性检出率。NGS检测利用基因组学的研究策略，研究标本包含所有微生物的遗传组成及其群落功能，检测病原体覆盖广泛，且无偏移，并能够以序列为基础，检测出新发病原体，还能深入提供病原体分型、毒力因子与耐药基因，指导临床治疗，并具有快速、病原体阳性检出率高等优点。但所有患儿入院后均已给予经验性的抗菌药物治疗，可能影响了微生物的培养，导致常规肺泡灌洗液的阳性率较低。本研究中NGS共检测出10种细菌、17种病毒、2种真菌，而传统病原微生物检测方法仅检测出4种细菌、2种病毒，提示相较于常规微生物检测，NGS检测的覆盖度更大、更全面。NGS能够在大部分传统方法检测阴性的标本中诊断出潜在感染的病原体，但二者的一致性较差，本次研究显示NGS检测与传统病原学检测一致性检验，Kappa值为-0.079，目前NGS尚不可替代传统实验检测成为“金标准”。本研究中，NGS检出细菌62例、病毒58例、混合感染63例，而传统微生物检测仅检出细菌4例、病毒2例、混合感染9例，提示NGS总的检出率高于传统方法，尤其在诊断病毒感染和混合感染方面更显著。NGS与常规ELISA、PCR等方法相比，其最大的区别为“非靶向”，即对检测标本中所存在的病原微生物“一网打尽”，防止患儿长期过多、过广地使用抗菌药物，实现从“精准诊断”至“精准治疗”，使患儿病程缩短，提高救治成功率，改善患儿预后。但NGS检测也存在一定的缺陷，如：(1)各检测机构的测序平台不一、数据库不同、标本处理的试剂耗材各异，病原微生物鉴定的覆盖度、测序深度及相对丰度不同；(2)结果的判读尚无统一标准，定植菌、致病菌的界定一般需由临床医师根按照患儿临床表现来判定；(3)诊断价格较高。故NGS尚不能完全代替传统的诊断方法，对于一些重症或难治性CAP患者经验性治疗效果不佳的，可作为一种补充手段来识别病原体。tNGS技术是结合NGS与PCR的优势，用超多重PCR正向富集目标病原体，检测灵敏度明显提升，同时可排除宿主核酸干扰，经测序和生物信息学分析可实现多种临床场景的核心病原体鉴定，如不同症候群、患者类型、感染脏器等。tNGS较mNGS极大提高了检测灵敏度，且可以同时兼顾DNA和RNA流程，检测时间明显缩短，具有可定制化、测序成本低、病原谱范围明确等优点。
综上所述，NGS在CAP病原体检测中的应用价值较高，能够提高病原体阳性检出率，指导临床调整治疗方案，以期更好地改善患儿预后。
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参考文献
[1]宁宁,陈强,王双,江超花,丁国际.肺泡灌洗液二代测序在儿童社区获得性肺炎诊疗中的应用价值[J].检验医学与临床,2023,20(9):1282-1286.DOI:10.3969/j.issn.1672-9455.2023.09.023.
